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Drop-Seqの変革-4つの主要な改善点

Drop-Seqの変革 – NadiaのscRNA-Seqにおける4つの重要な改善

急速に進化するゲノミクスの世界で、Drop-Seqがハイスループット技術の最前線でその地位を維持するのを助けるために、多くの作業が行われました。

Dolomite Bioでは、オリジナルのDrop-Seq技術を取り巻くいくつかの課題を克服するシングルセルRNAシーケンス(scRNA-Seq)プロトコルを開発しました。

バルクRNAシーケンス手法は、平均的な読み取り値を提供するため、サンプルに存在する個々の細胞タイプの決定を防ぎます。 ただし、サンプルの複雑さをより深く理解する必要性が高まっています。 Drop-Seqなどの手法は、単一細胞の解像度で細胞集団の不均一性を研究できるため、多くの研究の可能性を開きます。

2015年、Macosko 他は、単一細胞トランスクリプトームの研究を可能にする液滴ベースのマイクロ流体アプローチであるDrop-Seqについて説明しました(Macosko他。2015)。 マイクロ流体デバイスを使用して、単一の細胞は、液滴内のオリゴでバーコード化された個々のビーズと一緒にカプセル化されます。 カプセル化に続いて、液滴は細胞溶解を起こし、mRNAはビーズに捕捉されます。 エマルションが破壊された後、逆転写が大量に行われ、cDNAが増幅されて、ライブラリーが作成されます。

✅細胞捕捉率は、Drop-Seqのようなアプローチの重要なパラメーター

捕捉率は、シーケンスされる最初の単一細胞のパーセンテージの尺度です。これは、液滴内のビーズと一緒にカプセル化されている細胞の割合と一致します。言い換えれば、捕捉率のパーセンテージは、ビーズを含む液滴のパーセンテージに等しいです。

 

Drop-SeqおよびDrop-Seqのようなアプローチの捕捉率は、カプセル化を達成するために使用される手法や機器の影響を受けません。しかしながら、より高い初期ビーズ濃度がより高い捕捉率を可能にするので、捕捉率は、ビーズの初期濃度に直接依存します。したがって、様々な初期濃度で様々な種類のビーズをロードできるため、硬くて変形しない、または柔らかくて変形可能なビーズのタイプが重要な役割を果たします(図1)。

図 1: 細胞補足率。この率は、ビーズ濃度と使用するビーズのタイプに直接影響されます。

 

硬い非変形性ビーズであるChemgenesビーズは、NadiaプロトコルのscRNA-Seqでµlあたり600ビーズの初期濃度で使用されます。 この初期ビーズ濃度は、約11%の細胞捕捉率に相当します。 このプロトコルの最初のハードビーズ濃度は、低いビーズダブレット率を確保するために選択されました。

Nadia Innovateは、多くの柔軟性を提供し、パラメータと試薬の変更を可能にし、科学者が個人のプロジェクトに合わせたプロトコルを開発する独自の可能性を提供します。

 

例えば、ヒドロゲルで作られた変形可能なビーズは、はるかに高い濃度でロードすることができます。 Nadia Innovateを使用すると、scRNA-Seqを実行および更新して、70%を超える捕捉率を達成できます。

 

✅Nadia独自の機能を使用して、ユーザーは低い細胞ダブレット率を達成可能

細胞を含む小滴の平均占有率は、初期の細胞濃度と生成される小滴の体積によります。

初期の細胞濃度または生成される液滴の量のいずれかを増加させると、細胞を含む液滴の平均占有率が直接増加します。 Nadiaプラットフォームなどのマイクロ流体デバイスでは、液滴内の細胞カプセル化はポアソン分布に従います。したがって、0、1、2、またはそれ以上の細胞を含む液滴の数を決定することが可能です。 液滴の量または開始細胞濃度を増加させると、2つ以上の細胞を含む液滴の数が多くなります。

 

ただし、他にも考慮すべき重要なパラメーターがあります。 ほとんどのマイクロ流体プラットフォームでは、細胞は、再懸濁の方法なしで実行の期間中、リザーバーに保持されます。 したがって、細胞はラン全体で徐々に定着し、それによってダブレット率が増大します。 ダブレットの数を減らし、真の単一細胞データを達成するために、Nadia Instrumentは独自の攪拌技術を使用して、カプセル化プロセス全体で細胞を均一に懸濁します(図2)。

さらに、Nadia Instrumentの正確な圧力制御により、サイズの変化が少ない高度に単分散のエマルションが生成され、低いダブレット率が保証されます。 全体として、これらの利点により、Nadia上のscRNA-Seqは、細胞型または凝集しやすい核をアッセイする場合でも低い細胞ダブレット率を維持できます(図2)。

 

図2:細胞ダブレット率。 ナディアの独自の機能により、低い細胞ダブレット率が達成されます。

 

ダブレット率を評価するには、混合種のscRNA-Seq実験を行うことが重要です。 2つの異なる種の細胞を1:1の比率で混合することにより、複数の細胞を含むダブレットの数を決定できます。 ヒトHEK細胞とマウス3T3細胞の両方を使用して、NadiaでscRNA-Seq実験を行いました。 各ビーズに結合したマウスとヒトのmRNA分子の比率は、2つの異なる種の2つの細胞が1つのビーズでカプセル化されている場所を示します。同じ種のダブレットを算出するには、混合種イベントに対応する値に2を掛ける必要があります。

NadiaでscRNA-Seqを使用した混合種の実験では、約6,000の細胞を捕捉すると、細胞のダブレット率が4〜7%であることが示されました。 捕捉されるセルの数が少ない場合、このパーセンテージは大幅に減少する可能性があることに注意してください。 例えば、3,000の細胞を捕捉する場合、約1.5〜3%のダブレット率を期待できます。

 

✅Nadiaプラットフォームを使用して予算内でより多くのプロジェクトを実行する

単一セルのトランスクリプトームワークフローは、特にそれらが独占的に市販されている試薬キットに限定されている場合、費用がかかる可能性があります。 Nadiaのユーザーは、Dolomite Boから完全に品質管理されたキットを購入するか、供給者から試薬を購入することができます。 私たちのプロトコルはオープンソースであるため、試薬とその部品番号の詳細なリストを提供しています。これにより、ユーザーは供給者から直接試薬を購入できます。そうすることで、他のscRNA-Seqキットの数分の1のコストでscRNA-SeqをNadiaで実行できます。この試薬の柔軟性は、NadiaでのscRNA-Seqを手頃な価格と考えられるポイントの1つにすぎません。研究者は予算内でより多くのプロジェクトを完了することができます。

Nadia Instrumentで実行すると、scRNA-Seqはスループットの規模変更のメリットも得られます。 1、2、4、または8つのサンプルを同時に実行でき、各サンプルは20分の実行で最大6,000の単一細胞トランスクリプトームを捕捉します。 さらに、この規模変更は費用に大きな影響を与えることなく提供されるため、ユーザーは実験のニーズに最適なカートリッジを選択できます。

 

Nadiaプロトコルを使用して作成されたcDNAライブラリは、市場で入手可能なすべてのシーケンスプラットフォームと互換性があります。さらに、dropSeqPipeなどの完全にオープンソースのバイオインフォマティクスパイプラインを使用して、バイオインフォマティクス分析を実行できます。

さらに、NadiaでのscRNA-Seqのワークフローにより、ビーズに結合したままのcDNAで増幅ステップが実行されるため、単一のサンプルから収集された全てのトランスクリプトームのサブサンプリングが可能になります。 Drop-Seqでは、全てのビーズで一括して行われる逆転写の後、ビーズに結合したcDNAからPCR増幅が開始されます。 ユーザーは、特定の数のビーズを選んでPCRを行うことで、シーケンスしたい細胞の数を選択できます。 増幅は単一細胞のトランスクリプトーム全体で行われるため、これにより、複雑な情報を保持できます(図3)。 これにより、ユーザーは細胞の代表的なサブセットをテストして、完全なサンプルの発現レベルに関する洞察を得ることができます。

ただし、inDropを使用する場合など、他の方法でサブサンプリングを行うのは簡単ではありません。inDropでは逆転写後、cDNAが液滴内のビーズから放出されます。エマルジョンが破壊されてcDNAが回収されると、捕捉されたすべての単一細胞トランスクリプトームが混合され、混合cDNAに対して増幅が行われます。 この時点でのサブサンプリングは、完全なトランスクリプトームではなく、捕捉された各細胞に由来する少量のcDNAを取得することと同じです。各細胞の全cDNAの一部しか分析されないため(図3)、これは潜在的にデータをより高い発現レベルの遺伝子に偏らせます。 Drop-SeqおよびinDrop手法の詳細については、こちらをご覧ください。

 

図3:Drop-SeqおよびinDropでのサブサンプリング

 

これらの各手段を合計すると、NadiaでのscRNA-Seqは、Drop-Seqだけでなく、シングルセルシーケンスにおいて非常に手頃な価格に収まります(図4)

 

 

 

図4:予算内でより多くのプロジェクトをNadiaで行えます

 

✅NadiaでのscRNA-Seqは速くて便利です

Drop-Seqは2015年の創業以来、多くの最適化をしてきました。

Dolomite Bioでは、Drop-Seqプロセスを合理化して、使いやすさを向上させ、ベンチでの時間を短縮しました。

まず、Nadia InstrumentのscRNA-Seqは規模の変更に柔軟性があります。最大8つのサンプルを同時に実行でき、それぞれが20分の実行で最大6,000の単一細胞トランスクリプトームを生成します。プロトコルは、NadiaのscRNA-Seqに特有の迅速なフィルターベースのエマルジョン破壊法を使用しています。 最後に、Nadia上のscRNA-Seqの試薬キットはバッファーの準備を必要としないため、ライブラリーを迅速に生成できます。

一部の液滴ベースのワークフローに共通する、より複雑な化学エマルジョン破壊技術の代わりに、フィルターベースのエマルジョン破壊ステップが、NadiaプロトコルのscRNA-Seqで使用されます。 これにより、分離ステップの数が9から3に減少し、実践時間はサンプルあたり30分から10分未満に減少します(図5)。

 

 

 

 

 

 

図5:フィルターベースの新しい手法でより簡易になった乳剤の破壊ステップ。

洗浄ステップの数とcDNAに進むのにかかる時間を減らすことにより、データ収量が向上します。NadiaでscRNA-Seqを使用すると、より多くのビーズを保持し、より多くのSTAMPを取得して、mRNA分解の影響を減らすことができます。

NadiaプロトコルのscRNA-Seqに組み込まれた時間節約対策により、単一化された細胞から1日半以内にシーケンシング可能なライブラリーを快適に取得できます。

 

要約

Dolomite Bioによって開発されたscRNA-Seqプロトコルは、元のDrop-Seq技術を取り巻くいくつかの課題を克服します。 Nadia機器ではソフトビーズとハードビーズを使用でき、Nadiaの革新により、ユーザーは実験のニーズと必要な細胞捕捉率に基づいて、最も適切なビーズタイプを選択できます。 Dolomite Bioのプラットフォームは、スターラー、温度コントローラー、3つの独立した圧力ポンプなどの他の市販のマイクロ流体デバイスと比較して、いくつかの独自機能を備えています。 スターラーは、細胞とビーズの両方がよく均質化されることを保証し、ダブレット率を減らします。

さらに、NadiaのscRNA-Seqプロトコルはオープンソースであり、試薬の柔軟性を可能にします。これとスループットの規模変更、シーケンスの多様性、無料のバイオインフォマティックパイプライン、サブサンプリングの可能性を組み合わせることで、Nadia上のscRNA-Seqを手頃な価格のscRNA-Seqの形式にします。予算内でより多くのプロジェクトを実行できます。

最後に、Nadia上のscRNA-Seqは、高速で実行しやすいように開発されました。 プロトコルは、例えば、フィルターベースのエマルジョン破壊ステップの追加により完全に最適化されています。このステップでは、cDNAの処理にかかる時間を短縮することで、サンプルがmRNA分解の影響を受けにくくなるため、データの収量が向上します。

参照

Macosko, Evan Z., Anindita Basu, Rahul Satija, James Nemesh, Karthik Shekhar, Melissa Goldman, Itay Tirosh, et al. 2015. ナノリットル液滴を使用した個々の細胞の高度並列ゲノム全体の発現プロファイリング’. Cell 161 (5): 1202–14.

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