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一滴ずつワクチンを作成する

一滴ずつワクチンを作成する

COVID-19の最近の発生により、新旧の病原体の全範囲に対するワクチンの迅速かつ効率的な開発および生産の必要性が強調されました。

マイクロフルイディクス技術は、特に組換えDNAに基づくワクチンの生産に使用される菌株および宿主生物の定方向進化において、多くの方法でワクチン開発プロセスを加速するために使用できます。この強力な液滴技術をアジュバントの製剤に使用することにはもちろん、ワクチン粒子自体のカプセル化にも大きな利点があり、何十億回ものワクチン用量に相当する量に生産を拡大する可能性があります。この記事では、ワクチン製造における最近の急速な進歩の概要を示し、マイクロフルイディクスが今日の世界が直面している緊急の危機においていかに貴重であるかを示しています。

ワクチン接種は多くの疾患の管理において中心的な役割を果たしており、エドワード・ジェンナーと彼の同時代人の多くが18世紀後半に天然痘に対する接種を成功して以来、世界的に広く使用されてきました。予防接種は、病気の原因となる微生物を代表する生物学的製剤を健康な個体に導入すると、その個体に対する抗体を産生する個体につながるという原則に基づいて機能します。1700年代後半、牛痘は天然痘のプロキシとして使用されました。これは似ていますが、毒性ははるかに低いため、ウイルスは穏やかな症状を引き起こします。このアプローチは、微生物の死んだ(全体が不活性化された)または弱められた(生きた状態で弱毒化された)フォームを使用することによってすぐに取って代わり、感染につながるワクチン接種のリスクを減らしました。

より最近の開発は、組換えまたは合成DNAを使用して、病原菌からの単一の毒素または表面抗原のみを表す生体分子を生成することです。この正確でターゲットを絞ったアプローチにより、より一貫した免疫応答と保護レベルが保証されます。そして、そのような方法で抗原を提示するように設計された様々な戦略を使用してさらに強化する、または他の分子と組み合わせて、可能な限り強力な免疫応答を促進します。

 正確な方法または組み合わせは、病原体の種類(細菌、ウイルスなど)、その突然変異率、およびそれが個人の免疫系にどのように影響するかによって異なります。

ウイルスワクチン開発への新しいアプローチ

ウイルスに対する有効なワクチンの開発は、潜在的な標的抗原の組み合わせが少数な為、特に困難です。例えば、SARS-CoV-2ゲノムは、ヒトの20,000を超えるタンパク質コード遺伝子と比較して、わずか29のタンパク質をエンコードします。そして、突然変異率も高いのです。この要因の組み合わせにより、必要な免疫応答を引き起こし、長期的な予防を提供する抗原を選択することがはるかに困難になります。ウイルス性病原体に対するワクチンの開発には様々な戦略があります(図1)。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

図1 ウイルス性病原体に対するワクチンの開発に使用される複数のアプローチをまとめた概略図。

これらには、2つの従来のアプローチ(不活化ウイルス全体または弱毒生ウイルスのいずれかを使用)だけでなく、以下に簡単に概説するいくつかの分子工学技術も含まれます。

合成ペプチド

ほとんどのウイルスタンパク質は数百アミノ酸の長さですが、免疫系によって認識される抗原は、多くの場合比較的短い配列またはペプチドです。したがって、完全に合成されたペプチドを使用して、この免疫原性配列を模倣し、望んだ免疫保護応答を生成することが可能です。この戦略の利点は、短い配列が変異または修正を受ける可能性がほとんどなく、病原体や毒性物質が生産に必要とされないことです。合成ペプチドを化学的に変化させて安定性を改善したり、オフターゲット効果を低減する可能性もあります。このアプローチの欠点は、多くの抗原が単純な線形アミノ酸配列ではなく、ウイルスタンパク質の複雑な3次元フォールディングに依存しているため、免疫原性エピトープを特定するために三次タンパク質構造の面倒なモデリングが必要になることです。

組換えウイルスベクター

あるウイルス(標的)から別のウイルス(ベクター)に抗原タンパク質を符号化する遺伝物質を挿入すると、標的からの感染のリスクなしに免疫応答を生成するための潜在的な経路が提供されます。このアプローチでは、時々感染を防ぐために自身のゲノムの一部が削除された、病原性の異なるウイルスの弱毒化された形態を使用することがよくあります。 次に、組換えウイルスに感染した(形質導入された)宿主細胞は、抗原タンパク質を産生し、免疫認識と免疫をもたらします。

組換え細菌ベクター

組換えウイルスベクターと同様に、サルモネラ菌、大腸菌またはマイコバクテリウムなどの多くの細菌を使用して、標的ウイルスの遺伝子を宿主に導入することができます。ウイルスベクターと同様に、弱められた形のバクテリアは一般にバクテリア感染のリスクを減らすために使用されますが、それでも標的抗原の細胞内発現を可能にします。

 

プラスミドDNAワクチン

より最近の直接的アプローチは、プラスミドを使用して、抗原産生遺伝子を宿主に直接導入(トランスフェクション)することです。次に、宿主細胞は、感染因子の非存在下で抗原ペプチドまたはタンパク質を産生します。これは、ワクチンの安定性と製造の容易さの点で合成ペプチドワクチンと同様の利点を提供し、補助剤(細胞侵入を助ける)やアジュバント(より強い免疫反応を刺激するため)と組み合わせることができます。

ウイルス様粒子(VLP)

VLPはウイルスによく似ていますが、ウイルスの遺伝物質を含まないため、感染性はありません。それらはしばしばウイルス構造タンパク質のインビトロ発現を通じて産生され、次いでそれは自己集合して標的ウイルスを模倣する三次元構造を作成します。VLPは不活化または弱毒生ウイルス全体と同様に作用し、場合によってはより強い免疫応答を生成することが示されています。また、感染のリスクがなく、これらの従来のワクチンよりも迅速かつ簡単に製造できるという利点もあります。

組換えサブユニットウイルスタンパク質

これらのワクチンは、組換えウイルスまたは細菌ベクターワクチンと同じ技術と免疫応答に依存していますが、完全なウイルス遺伝子をベクターに挿入する代わりに、タンパク質の単一サブユニットの遺伝物質のみが使用されます。この戦略の利点には、遺伝子改変が容易になること、標的病原体の変異によりワクチンが無効になるリスクが軽減されることなどがありますが、効果的な予防を確保するには、抗原エピトープの構造とウイルスの変異率に関するより具体的な知識が必要です。

マイクロフルイディクスの役割

ワクチン開発への分子工学的アプローチは、不活性化または弱毒化されたウイルスの使用に比べて様々な利点を提供し、正確な利点は対象の方法と病原体に依存します。しかしながら、全ての最新のワクチン開発アプローチの主な課題は、病原性ウイルスの遺伝子配列の知識に依存していることです。これは、現在の次世代シーケンシングテクノロジーの低コストと高スループットの問題ではなく、免疫につながる抗原性エピトープの特定です。 そして、正しいエピトープが特定された後も、関連する遺伝的要素を分離して、適切なベクターまたは生物生産生体に挿入する必要があります。

いずれの場合も、このプロセスは数の勝負であり、最も適切なウイルス抗原を決定および分離し、関連する遺伝子配列をベクターまたは生物生産微生物に挿入し、最適なワクチン製剤を確立するために数百または数千の実験を必要とします。これらの実験の多くは、数万の個々の細胞の評価も必要とするため、効果的なハイスループット分析の技術が不可欠です。 マイクロフルイディクスは、ワクチン開発を支援および加速する強力なツールであり、シーケンシングまたは株評価のための単一細胞カプセル化から、アジュバントおよびワクチン送達粒子のハイスループット生成まで、全てに便利なソリューションを提供します。

単一細胞RNAシーケンス

単一細胞RNAシーケンス(scRNA-Seq)は、細胞レベルでの組織の基本的な理解を向上させ、免疫系が病原体と相互作用して感染を取り除き、免疫を発達させる方法を改善するための必須ツールとしてますます認識されるようになりました。個々の細胞を分離して研究する能力は、樹状細胞の真の多様性や多数の新規T細胞調節因子の識別など、多くの重要な発見につながっています。

また、ワクチン開発の重要な補助手段であり、感染した細胞内のウイルス遺伝物質をその場で迅速に識別して、抗原の選択を支援します。

 

scRNA-Seqは、数千の単一細胞のトランスクリプトームを単独で取得することに依存しており、一般に「drop-seq」プロトコルを使用して実行されます。このプロトコルでは、数万の単一細胞が独自にバーコード化されたmRNAキャプチャービーズで個別にカプセル化されます。このキャプチャされたmRNAは、逆転写(RT-)PCRを受けて、シーケンシングの準備ができたcDNAライブラリーを生成します。マイクロフルイディクスは、従来のアプローチとは異なり、個々の細胞を高スループット形式で効率的にカプセル化するための正確な再現性があり自動化可能な方法を提供するため、この分野での実現テクノロジーとなっています。このアプリケーション用に特別に設計された高度に自動化された市販のマイクロフルイディクスセットアップの導入により、この手法が幅広いラボに開かれ、マイクロフルイディクスの専門知識を必要とせずに社内での簡単なカプセル化が可能になりました。

 

組換え核酸ワクチン

核酸組換え–ある生物から別の生物へのRNAまたはDNAの転置は現在、様々な方法を使用して、世界中の何千もの研究所で日常的に行われています。ただし、使用する手法に関係なく、このアプローチは、新規の遺伝物質を個々の生物の数万または数十万(場合によっては数百万)に同時に挿入する試みに依存しています。次に、得られた遺伝子組み換え生物(GMO)をスクリーニングして、標的配列の挿入と発現の成功を確認する必要があります。

フローサイトメトリーと蛍光活性化細胞選別(FACS)は、このタイプのスクリーニングで一般的なアプローチになり、個々の細胞の迅速な評価と選別を可能にします。特にスループットの低いアプリケーションでは必須ではありませんが、マイクロ粒子への細胞のカプセル化は、フローサイトメトリーに多くの利点をもたらします。マイクロ粒子は機械的に安定しており、細胞の剪断を減らし、より高い流速を可能にします。細胞と蛍光試薬の同時カプセル化により、より幅広いパラメーターをアッセイできます。一貫性のある個別のカプセル化と粒子のサイジングにより、背景の「ノイズ」が減少し、大規模なデータセットの分析が簡素化されます。マイクロフルイディクスの最近の進歩により、このアプローチははるかにアクセスしやすくなり、シングルおよびダブルの両方のエマルジョン粒子を簡単かつ自動化して様々なワークフローに適合できるカプセル化システムが数多く市場に出回っています(例:カプセル化装置、ドロマイトマイクロフルイディクス )。

ウイルス抗原の生産

免疫反応を直接刺激するためのウイルス/合成ペプチド、VLP、およびウイルスタンパク質サブユニットの生成には、核酸最終産物ではなくアミノ酸を使用しますが、生産組換え核酸ワクチンへの同様の遺伝子工学的アプローチが必要です。 図2に示すようなバイオ製造ワークフローは、非常に複雑でスケールアップが困難な場合が多く、目的の最終タンパク質を効率的に発現させるには、慎重なクローン選択とプロセス最適化が必要です。したがって、個々の細菌または真核細胞のマイクロ流体カプセル化は、バイオ製造にとって重要なツールであり、プロセス開発の様々な段階でのスクリーニング活動の有効性の向上に役立ちます。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

図2 B型肝炎(HB)ワクチン製造の略図。HBウイルスから単離された抗原産生遺伝子は、細菌プラスミドベクターに挿入されます。次に、このベクターを使用して酵母細胞を形質転換し、発酵タンクで成長させてHB抗原を生成します。その後、HB抗原を単離および精製して、HBワクチンを生成します。

デリバリー粒子の生成

希望の免疫原性物質が生成された後も、標的ウイルス病原体からの予防を提供するのに十分に強い免疫応答をもたらす方法で、体内に送達される必要があります。ナノ粒子またはマイクロ粒子にワクチンまたは治療薬をカプセル化することは、薬物送達のための人気のある方法であり、安定性、毒性、および溶解性の問題を克服して薬物動態および薬力学を改善するのに役立ちます。例えば、遊離の免疫原性物質は、不安定すぎて分解せずに輸送および保管できないか、体内に入ったときに代謝が速すぎて、十分な免疫応答を刺激して長期的な予防を提供できない可能性があります。

生分解性ポリマーやリポソームなど、薬物やワクチンのカプセル化用に開発中の粒子には様々な種類があり、粒子の正確な設計は、粒子が提供する予防の程度、放出と吸着の速度、さらには放出の場所にさえ影響を与える可能性があります。タンパク質または抗体を粒子の外表面に結合させ、特定の細胞タイプを標的にします。したがって、粒子の正確なサイズと組成、およびカプセル化の効率が重要です。マイクロフルイディクスの速度、再現性、およびスケーラビリティは、ワクチンのカプセル化に最適であり、開発中に粒子製剤を簡単かつ確実に調整する機能を提供し、大規模生産(Telos、ドロマイトマイクロフルイディクス)への簡単なルートを提供します。

アジュバント製剤

免疫系に正しい形態の免疫原性物質を提示することは、免疫を提供するために必要な免疫応答の強さを生み出すのに必ずしも十分ではありません。これらの例では、アジュバントが標的抗原と一緒に投与されることが多くあります。アジュバントは直接免疫を与えるのではなく、何らかの方法で標的抗原に対する免疫系の反応を刺激します。これは、抗原が体内に存在する時間を延長したり、抗原提示細胞による取り込みを増加させたり、マクロファージやリンパ球を活性化したり、サイトカインの生産をサポートしたり、全体的な免疫応答を増幅する刺激物として作用したりすることができます。

今日使用されている最も一般的なアジュバントは、70年以上使用されている水酸化アルミニウムですが、特定の免疫応答要素のより的を絞った刺激を提供する新世代のオイルおよびエマルジョンアジュバントが開発されています。これらの新しいアジュバントの多くは、標的抗原を含む懸濁液のナノ粒子またはマイクロ粒子の液滴として投与され、マイクロ流体技術を使用して製造されています。例えば、サポニンベースのアジュバントが最近いくつか報告されており、サポニンの正確な製法と糖鎖の長さが、特定の抗原との組み合わせで効果を決定します。

マイクロフルイディクスによって提供される流量の一貫性と細かい制御により、サポニンベースのアジュバントの開発において貴重なツールとなり、ハイスループット生産のためのスケーラブルな方法を提供するだけでなく、複数の試薬を正確な比率で組み合わせて、スクリーニング用の化合物の大きなライブラリーを生成できます。サポニンはまた、別の興味深いクラスの新規アジュバント、つまり免疫刺激複合体(ISCOM)の重要な要素でもあります。これらは、特定の植物由来のサポニンが特定の条件下でコレステロールやリン脂質と混合されると自然に形成される、直径約40nmの球状構造です。結果として生じるケージのような複合体は、免疫刺激特性を持ち、より強い免疫応答とより長い予防を誘導するのに役立ちます。

 

要約

ここで説明する様々な例は、ワクチンの開発と製造におけるマイクロ流体技術の幅広い適性を示しています。

現在利用可能な高度な計装によって提供される再現性、スケーラビリティ、および精度は、これまでマイクロ流体工学を採用していなかったアプリケーションの可能性を開き、分析を簡素化し、研究を加速します。以前より多くのラボが優れたカプセル化効率、粒子生成、および反応制御マイクロフルイディクスのメリットを活用しているため、この傾向は今後も続くでしょう。 DDW

 

リチャード グレイは、Dolomite Microfluidicsの粒子工学およびマイクロ流体技術担当副社長です。 彼はケンブリッジ大学で工学の修士号を取得し、経営学の学位を取得しています。過去には、テクノロジーパートナーシップ、PAテクノロジー、ウェストランドヘリコプター、メトラートレド、シリスで技術的な地位を歴任してきました。

Drug Discovery Worldより、下記本文

https://www.ddw-online.com/enabling-technologies/p323645-creating-vaccines-drop-by-drop.html